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陰性對照出現陽(yáng)性結果
試劑 / 樣品污染
試劑和樣品可能被污染,或者由于孔之間的濺灑交叉污染。使用新鮮試劑,小心操作移液器。
夾心 ELISA - 檢測抗體與包被抗體反應
確定使用的是正確的包被抗體和檢測抗體 , 他們之間不會(huì )互相反應。
酶標板洗板不徹底
用洗液充滿(mǎn)板孔確保每孔被充分洗滌,洗板前確保所有的剩余抗體溶液被倒凈。
抗體量過(guò)多導致非特異結合
根據推薦用量使用抗體。盡量使用較少的抗體。
酶標板整體背景高
結合反應太強或時(shí)間過(guò)長(cháng)
檢查底物的稀釋?zhuān)褂媒ㄗh的稀釋度。當酶標板顯色足夠進(jìn)行吸光度讀取時(shí)立即用終止液終止反應。
底物溶液或終止液不是新配制
使用新配制的底物溶液。終止液應該是清亮的(如果它變黃,這是被污染的標志,需要重新配制) 。
沒(méi)有終止反應
如果底物反應沒(méi)有被終止,顏色會(huì )繼續變化。
酶標板在酶標儀讀板前放置時(shí)間過(guò)長(cháng)
顏色會(huì )繼續變化(盡管加了終止液,依然會(huì )以很慢的速度變化 )。
試驗器皿污染
確保試劑是新配的并且使用的是清潔的玻璃器具。
底物孵育應該在避光條件下進(jìn)行。
抗體在適宜的溫度下有最佳的結合活性。確保孵育在正確的溫度下進(jìn)行,孵育箱要設定好適宜的溫度并正常工作。孵育溫度可能 需要一些優(yōu)化。
確保進(jìn)行了封閉并使用的是恰當的封閉液。我們建議使用 5-10% 的與二抗同種動(dòng)物來(lái)源的血清或牛血清。
確保板孔經(jīng)過(guò)預處理以防止非特異結合。使用親和力強、純度高的抗體,最好經(jīng)過(guò)了預吸收。
請檢查針對“陰性對照出現陽(yáng)性結果”的建議
吸光度數值低
檢查靶蛋白表達系統,確保它在您的樣品中被表達出來(lái)。如果靶蛋白的表達水平低,需要增加樣品使用量,或者您可能需要選擇 一個(gè)更靈敏的測定方法。確保您使用的是沒(méi)有超出測定方法檢測范圍的陽(yáng)性對照。
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